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3D脑类器官-阿尔茨海默病研究新工具!

时间:2019-11-05   浏览次数:90次


原创: STEMCELL

阿尔茨海默病(Alzheimer's diseaseAD)是最常见的神经退行性疾病。Alzheimer's associationAAIC)的数据显示:

l AD是美国排名第六的致死原因。

l AD患者的看护需要大量的精力,也给家庭带来?#21496;?#22823;的经济负担。

l 2000-2017年间,死于?#33041;?#30142;病的患者下降了9%,而死于AD的患者增加了145%

l 3个老年人中就有1个死于AD或者另外一种痴呆(dementia)。

l 2019年,ADdementia在美国预计的花费为2900亿美金,这个数字预计会在2050年到达11000亿美金。

l 2019年,美国AD患者的人数在580万,这个数字预计在2050年到达接近1400万。

*数据来源:2019 Alzheimer's Disease Facts and Figures Report

引起AD?#33041;?#22240;目前尚未明确,疾病发展目前认为与大脑中的Beta-AmyloidTau蛋白有关,近期也有研究认为大脑中的免疫细胞 - 小胶质细胞可能介?#21058;?span>Tau蛋白聚集。目前AD的研究工具包括原代神经元,转基因动物模型,3D脑类器官等。

3D脑类器官

灵长类动物的大脑是高度复杂和有组织性的结果,2D?#33041;?#20195;神经元模型包括hPSC衍生的神经元模型重现脑组织复杂结构的能力较为有限,而啮齿类动物(包括小大鼠)与灵长类动物的大脑相比结构更加简单(不含有OSVZ区域)。hPSC衍生的脑类器官则是一种三维(3D)体外培养系统,能够重现人脑发育过程和发育中的人脑结构。它们提供了一种模拟人体生理环境的体外模型,专用于研究人神经系统特有的神经发育和疾病过程。

而从FAD和一些SAD病人的iPS衍生的神经元具有Tau蛋白的磷酸化水平升高和Beta-Amyloid聚集,从AD病人来源的3D脑类器官也同时具有Beta-Amyloid的聚集和类似neurofibrillary tanglesTau磷酸化水平升高。因此,近期也有很多科学家使用3D脑类器官进行AD?#21335;?#20851;研究。

STEMdiff?脑类器官试剂盒为无血清培养系统,用于从人ESiPS生成脑类器官。它是基于由Madeline LancasterJürgen Knoblich教授所发布的配方1

?#23478;? width=

1. 使用STEMdiff?脑组织类器官试剂盒生成的脑组织类器官

A)使用STEMdiff? 脑组织类器官试剂盒在第40天生成的整个脑组织类器官?#21335;?#20301;对比图。箭头所?#22797;?#20026;皮层类似区域。(B)免疫组化分析结果显示这些皮层类似区域具有顶祖标志物PAX6(红色)和神经标志物β-tubulin III(绿色)。(C-F)(B)图框内区域的放大图像。(CPAX6 (红色) / β-tubulin III (绿色)。(D CTIP2 (红色) / β-tubulin III (绿色)。(E)和(FKi-67(绿色)和核染料DAPI(蓝色)共同标记?#33041;?#27542;中的组细胞。(F)室下区类似区域可见一个额外的Ki-67+细胞群。比例尺=A1 mm,(B500 μm 和(C-F200 μm。在培养脑类器官时,?#32957;?#20123;未经质控的自配试剂相比,该试剂盒显著提升了类器官(包括从难分化的细胞系)形成的效率(图2)。

图二

A)图2. 与使用未经质控的试剂所生成的脑类器官相比,使用STEMdiff?脑类器官试剂盒生成的脑类器官在质量、产量和标志物表达?#31995;?#34920;现都更为优异。

A)使用STEMdiff?脑类器官试剂盒生成的脑类器官,在第40天发展出厚组织样结构,?#25233;本冻?#36807; 1 mm。(B)使用未经质控的试剂生成的类器官在第40天并未发育出厚组织,而是形成了?#27927;?#30340;含液胞囊。(CRT-qPCR分析显示,在使用STEMdiff?脑类器官试剂盒所生成的脑类器官中,神经祖细胞与成熟神经元出现?#31995;鰨唬?span>D)对比之下,采用未经质控的试剂生成的类器官显示出较差的神经元标志物表达(平均数 ± SEM,每个细胞系的n = 2;每个分析涉及6个类器官)。数据以18S/TBP为标准,并与未分化的hPSC对照组相比较。(A)和(B)的比例尺 = 1 mm

已使用脑类器官进行造模的疾病有:

l 小头畸形2

l ZIKA病毒诱导的小头畸形3-6

l 可卡因的作用7

l 自闭症谱系障碍/提摩西综合症8

l 阿尔茨海默病9

l 小胶质瘤10

l Miller-Dieker综合症11-12

如?#26410;?#20154;多能干细胞生成脑类器官?

如?#26410;?#20154;多能干细胞生成脑类器官?#21335;?#32454;操作?#34903;瑁?#21253;括类胚体的形成、神经诱导、神经上皮扩张和类器官的成熟(图3)。

图三

3. 脑类器官生成示意图

将在mTeSR1?中维持培养的人多能干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)使用温和细胞解离试剂(GCDR)解离为单细胞悬?#28023;?#20197;密度为9000细胞/孔接种至U-Bottom 96孔超低粘附培养板(Corning®)中,接种培养基为EB形成培养基 + 10 μM Rho-kinase抑制剂(ROCKi)。每隔2天更换为不含ROCKiEB形成培养基。5天之后,将EBs转?#39057;胶?#26377;诱导培养基的24孔超低粘附培养板(Corning®)中。对EB培养2天后,使用液体Matrigel®(减少生长因子,Corning®)包被EBs。接下来将它们转?#39057;?#32463;过无组织培养处理的6孔板(12-16类器官/孔)中。?#24230;?#30340;类器官在扩张培养基中维持培养3天。在第10天时,将类器官转换到成熟培养基中,然后放置在RPM57-95的定轨摇床(Infors HT)上对其进行培养。在成熟培养基中,每3-4天进行换液。在第40天时,类器官进行RT-qPCR分析或冰冻切片后进行免疫染色。EBs形成、诱导和类器官扩张的比例尺 = 300 μm。类器官成熟的比例尺 = 1 mm

原代神经元培养
标准化的神经元培养添加物(如Brewer's B27)包含了多种复杂的成分13-15。这些原料及相关制造过程的质量差异性都将导致该添加物的品?#23454;?#21464;化,已有报道表明?#20204;?#20917;会对神经元培养造成负面影响1516

图四

NeuroCult? SM1STEMCELL优化后的)是根据已发表B27配方1开发设计的,且经过优化,对于支持成熟神经元的培养具有更出色的一致性(图4)。NeuroCult? SM1神经元培养基添加物的设计和生产均为培养出可重复的、高品?#23454;?#22521;养物做了充足的准备。在开发过程中,我们首先对已发表的添加物进行了多因素实验13,14,确定NeuroCult? SM1的配方和原?#31995;?#31934;确规格。精选?#33041;?#26009;由可靠的供应商提供,并选用?#23454;?#30340;重组或合成原材料作为组分的替代物。随后,建立最佳的制造工艺来生产这些多组分添加物。

图4

4. 使用SM1培养体系培养的大鼠原代神经元具有突触前和突触后标志物的表达

SM1培养体系中培养的E18大鼠原代皮层神经元。在培养第21天,神经元表型成熟,具有广泛的树?#24739;?#34920;达和树突前标志物synapsinAC;绿色)和树突后标志物PSD-95AB;红色)的表达和分布。Synapsin集中在神经元胞体和轴突上分散的小突分布,轴突由MAP2AD;蓝色)标记。

与竞品(添加有B27Neurobasal®)相比,SM1培养系统中具有更多β-微管蛋白III阳性表达的神经元,细胞活力显著提升(图5),并且SM1批次间的稳定性要更好。另外,我们发现神经元在添加有SM1的培养基中具有更多的神经突生长/分支,以及正常的电生理特征(实验数据未显示)。

图五

5. SM1培养体系可大大提高细胞存活率

A)在SM1培养体系或竞品体系(添加有B27Neurobasal®)中培养21天的E18大鼠原代皮层神经元。在SM1体系中培养的神经元数量显著性高于竞品体系(n=4mean ± 95% CI*p < 0.05)。(B)在添加有SM1B27类似竞品(竞品123)的Neurobasal®中培养21天的E18大鼠原代皮层神经元。使用SM1培养的神经元数量与竞品相当,但批次间的稳定性?#32454;摺?span>

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货号

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NeuroCult? SM1 Without Vitamin A

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6. BrainPhys?完全培养基(BP)、Neurobasal®完全培养基(NB)、突触抑制剂(BP+抑制剂)和咖啡因(BP+咖啡因)条件下培养的神经元的平均连接率。

n=3(每个条件下进行了3次独立的细胞实验);one-way ANOVAF(3,8) = 854P<0.0001,使用Tukey's multiple comparisons检验:ns=不显著,????P < 0.0001。?#35745;?#24341;用自Saber WA et al. (2018) All-Optical Assay to Study Biological Neural Networks. Front. Neurosci. 12:451. doi: 10.3389/fnins.2018.00451的图4D。遵循CC BY 4.0. Copyright © 2018 Afshar Saber, Gasparoli, Dirks, Gunn-Moore and Antkowiak

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